三种植物组织培养及生根过程中酶活性变化pdf

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　　摘 要 本论文以紫叶挪威槭、一品红、萱草为材料，进行组织培养，建立再生体 系。研究了植物生长调节剂DPC和复合VB对一品红试管苗生长、芽增殖及生 根的影响。研究了三种植物生根过程中IAAO、POD活性的变化及POD同功酶 酶谱的变化。研究结果如下： 1．紫叶挪威槭最佳芽增殖培养基为MS+BAl．5mg／I．,(单位下同) 最佳生根培养基为1／2MS+IBA0．5，生根率为100％。 2．培养基中DPC浓度为5mg／L时，利于芽的增殖；浓度为10mg／L时，试 时，苗高显著增加；浓度为0．2-0．5mg／L时，促进根的分化，提高生根数量。 3．萱草和一品红IAAO、POD活化趋势有相似之处，IAAO活性先升高 褥降低，之后回舞；POD活性剐先降低后升高，之后略有下降。紫叶挪威槭生 根初期IAAO、POD活性大体都呈缓慢上升趋势，后期活性降低。当IAAO 和POD在各自的动态曲线中处于相对低水平时有利于生根。紫叶挪威槭IAAO、 POD起始活性较高，推测试管苗生根培养起始时期酶活性的差异可能也是造成 不同植物生根难易的一个影响因素。生根过程中POD同功酶酶谱发生变化。 关键词：组织培养；生根；嬲l哚乙酸氧化酶；过氧化物酶 Abstract Inthe and study,Acerplatanoides‘Crimson磁蜡’，Euphorbiaphlcherrima Hemerocalliswereusedas fortissuecultureandtheefficient hybrida explants plant wereestablished．Atthesame effectsofdifferent regenerationsystem time，the plant on and of growthregulatorsgrowing，shootpropagationrootingEuphorbia were studiedthe of and studied．Finally,wechangesenzyme phlcherrima activity peroxidaseisozymespectrumduringrooting． Theresultsshowedthatthemostsuitablemediunforshoot ofAcer propagation platanoides‘CrimsonⅪng’was and theshoot ratewas bestmediunfor Was 4．35；The MS+NAA0．1+ propagation rooting mA0．5+PG40andthe ratewas72．4％．Thebestmediumforshoot rooting of WasMS+BAl．0+IBA0．1andtheshoot propagationEuphorbiaphlcherrima rateWas rootmediumwas andthe 7．87；The 1／2MS+IBAl．0 propagation promoting of of rateWas idealmediumfordifferentiationadventitiousbuds rooting 82．6％；The was andthedifferentiationrate Hemerocallis MS+BAl．0+KTl．0+IBA0．5 hybrida was mediumof Was for oftube 93．3％；The 1／2MS+IBA0．5 rooting seedlings proper andthe ratewas100％． rooting TheresultsshowedthatDPCoflowerconcentrationhadeffecton enhancing the DPCcan of shootof 10mg／L multiplication Euphorbiapulcherrima．Adding the of andthetube became plantlets promotegrowthseeding plantlets stronger．Tube and the of had lowerstemundertreatment stronger DPC。Compound 30mg／L VitamineBat werefor oftube fit the height plants。 0．5-1．Omg／L increasing VitamineBat rootdifferentiationand Compound accelerate 0．2—D．5re#t,could increasetheamountofthe root． Theresultsshowedthat trendsof andPODin the IAAO change Euphorbia and of Hemerocallisweresimilar．Whilethe trends phlcherrima hybrida change Acer different．Italsoconclued IAAOandPODin King’were platanoides‘Crimson thatwhenIAAOandPODactivitieswereatthelower ofthe curves positionactivity benefit activitiesofthe inthe aninfluence maybe rooting。Theoriginal enzymeplants dederminethe has ctor,which isozymespectrum rootingability．Theperoxidase changedduringrootingstages。 words：Tissue acid oxidase；Peroxidase Key culture；Rooting；Indoleacetic 学位论文独创性声明 本人承诺：所堇交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究。论 文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表 过的研究，其他同志的研究对本人的和所提供的帮助，均已在论 文中傲了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 互嵩耷 日 期：刎罗，■弓。 ) 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的， 及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅 和借阕。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或郝分内容编入有关 数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名： 缯 指导教师签名： 日 期： 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 第一章文献综述 1．1植物组织培养介绍 植物组织培养是指通过无菌操作把植物体的各类结构材料，即外植体接种 于人工配置的培养基上，在人工控制的条件下进行离体培养的一套技术与 方法。广义的组织培养，不仅包括在无菌条件下利用人工培养基对植物组织的 培养，而且包括对原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养。根据培养的植物材 料不同，把组织培养分为5种类型，即愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官培 养(胚、花药、子房、根、茎的培养等)、茎尖分生组织培养和原生质体培养【lJ。 的细胞进行单细胞培养，提出了植物细胞具有全能性的设想，即植物的大多数 生活细胞，在适当条件下都能由单个细胞经、生长和分化形成一个完整植 株的现象或能力。由此被后来的学者称为“植物组织培养之父”【2J。1958年，英 国学者Steward对胡萝卜根组织进行单细胞悬浮培养获得成功，分化形成 了完整的植株，在实践中了该理论。二十世纪六十年代，一些学者从曼陀 罗、烟草、水稻等花粉培养获得单倍体植株，由此证明性细胞也具有全能性。 我国植物组织培养研究工作开展也较早，许多学者曾经做出了杰出的贡献。1931 年李继同培养银杏的胚获得成功。1935-1942年罗洛进行了玉米根尖离体培 养。其后，罗士伟进行了植物幼胚、根尖、茎尖和愈伤组织的培养。李正理等 研究了离体胚培养中形态发生及离体茎尖培养13J。20世纪70年代以来我国开展 植物花药培养进行单倍体育种，取得了一系列举世瞩目的成就。 近30年，随着试验材料范围的逐步扩大、培养基的不断改进、培养方法的 不断发展以及试验手段的逐步完善等，植物组织培养技术得到了突飞猛进的发 展，已被越来越广泛的用于扦插难生根植物、引种材料少的植物、脱除病毒的 材料、珍稀植物、观赏花卉以及商业特需苗木的无性繁殖，大大节省了人力、 物力，取得了巨大的社会与经济效益。另外，植物组织培养与其它技术相结合， 三种植物的组织培养殿生根过程中酶活性的变化 在创造植物抗病、耐盐碱、抗除草剂等抗逆性变异体及筛选突变体、次生代谢 物发酵生产、人工包装超级种子等方面取得了很大成就，并且为许多学科研究 植物生长发育、抗性生理、激素及器富发生与胚胎发生等提供了许多良好试材 和有效途径l训。 目前，植物组织培养的研究十分活跃，在国内外引起广泛重视，运用该项 技术作各种课题研究的入员与匿俱增，相信其会成为当代生物科学中最有生命 力的～门学科。 1．2三种植物研究进展 1。2．1紫叶挪威槭研究进展 槭树科槭属GlcerL．)通常泛称为槭树，习惯又称“枫”或“枫树”。全世界槭 树共有200余种，分布于亚洲、欧渊、洲及非洲北部。我国有160余种， 占全世界总数75％以上，全国各地均有分布，主产长江流域及其以南各省区。 槭树多系乔木或高大乔木，树干挺直，木材坚硬，材质细密，为室内装饰、家 俱、王具、建筑等的优良用材。有些槭树的树皮、果等富含蹂质、纤维，可作 烤胶、造纸原料或从树皮中提取抗癌药物。种子油可食用或工业用，有的嫩叶 可代茶作饮料，还有许多种类是很好的蜜源植物【51。槭树的树形丰富、姿态潇 洒，如有冠大荫浓、亭亭如华盖的元宝槭，也有树姿优美秀丽的鸡爪槭。槭树 豹叶形丰富多彩，有单时、掌状复叶及羽状复叶。槭树的叶色不仅有红色、黄 色，还有青、紫等色【6J。因此，槭树被誉为世界著名的观叶植物。 槭树作为重要的观叶树种，栽培苗木供不应求。槭树植物的繁殖目前主要 采用常规的扦插和播种繁殖方法。虽然，槭树科植物在大田里的生长有着很大 的容量，僵组培成功锻有限，仅有少数几个种建立了较为完善的组织培养再生 胞胚胎发生。Wilhelm[8J利用大槭树的幼芽、胚轴和胚根出了愈伤组织和不 的组织培养中芽增殖的作用。Durkovie[101在试管中对尖尾槭(Acer caudatifolium) 2 三种植物的组织培养殿生根过程中酶活性的变化 幼苗腋芽培养，建立了芽的繁殖和荐生培养体系。彭德芳【11】以美洲糖槭(Acer saccharum)的侧枝腋芽为外植体，成功在腋芽部位分化出芽。孟月娥等瑟刁采用 Maxim)苗木的工厂化生产。李艳敏等睢3l 组培技术实现了茶条槭(Acerginnala 以嫩茎段材料建立了粉叶复叶槭(Acer negundolinnFlamingo’)的再生体系。 综上所述，国内夕}对槭树科植物的组织培养研究较少。 紫叶挪威槭(Acerplatanoides‘CrimsonKing’)又名红帝挪威槭、耀王枫等， 为槭树科，槭树属，落叶乔木，原产欧洲。生长迅速、树形美观、叶片为紫红 色，具有观赏性强、耐寒性强、适应性强的特点，弥补了中国红枫和日本红枫 生长周期长，夏季叶片焦边，冬季不耐寒的缺点，是具有基大潜力的观赏树种， 也是园林装饰的优良树种，市场需求量大且价格贵，目前的栽培苗木供不应求。 挪威槭的繁殖主要采用常规的扦插和播种繁殖方法，扦插繁殖系数低，播种繁 殖的焉代易产生性状分离，而组织培养作为重要的快速繁殖技术可以弥补二者 的缺点。以休眠芽为铃檀体进行离体培养和植株再生，可在短期内实现大量快 速繁殖，加快育苗进程。 目前与紫叶挪威槭同属的有些槭的组织培养和快速繁殖已有过报道，但紫 叶挪威槭的组培报道来见。 1．2．2一品红研究进展 一鑫红(Euphorbiaphlcherrima)为常绿灌木，舅j名象牙花、老来娇、圣诞花， 是大戟科大戟属的重要花卉。原产墨西哥和中美洲，喜光、喜温暖湿润， 要求排水通气良好，疏松肥沃的微酸性土壤，适宜温度18--29℃，现国内各地 区均有栽培。其花本身并无多大观赏价值，总苞片呈叶片状，其绿色苞片在花 寄形成前至秋冬经短毯照条件变色，里鲜红、浅黄、淡自等颜色，是主要的观 赏点。一品红花期时逢圣诞、元旦和春节，正当其它观花檬物多数处于休眠阶 段时，它却身披绿叶，枝顶托以赤红艳丽的花瓣似的苞片展现在人们面前，十 分弓i入注哥，实为冬季优良的观赏植物箨引。 髫翁，国内对一品红的研究已很广泛，主要集中予不同品种、不同基因型 ～品红的离体培养及植株再生，多以幼嫩带腋芽的茎段为外植体，也可以茎尖、 叶片为外植体愈伤组织产生大量丛生芽，进而探讨一品红、芽增殖、 3 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 生根等各方面的影响因子。还有人研究了一品红胚状体的发生、不同理化因子 对生根的影响、低温理特性、苞片变色机理、矮壮素等生长调节剂对 花期及株型的调整等。 由于一品红很少结实，特别是一些优良品种枝条数量稀少，引种繁殖数量 有限。采取常规的扦插繁殖，不仅繁殖数量少，而且时间长，病毒病严重， 从而影响了一品红的发展。利用组织培养不僵可以在短期内实现一品红优瞧品 种的脱病毒及大量繁殖，还可与理化诱变处理相结合，简便迅速地进行一晶红 新品种选育116J。 1。2．3萱草研究进震 萱草(Hemerocallis hybrida)又称金针花、忘忧草、黄花菜等，是百合科 萱草属(Hemerocallis)的多年生草本宿根花卉，我国南北均可种植。叶熬状基生， 里条带状披针形，背面中脉突起；花茎高出叶片、上部有分枝，花大、花冠漏 斗形至钟形；蒴果，结实较岁17l；根状茎可在．20C低温冻土中越冬，对盐碱土 壤有特别的耐性。 萱草适应性强、叶丛姿态优美、花色花形丰富、花期长．可布置庭园、花 坛、马隔离带、疏林革坡等处，更适宜做地被植物，市场对其需求不断增加。 另外，萱草花有药食同功的双重功效，不但营养价值极高，且有极好的健脑效 果。其根及根茎入药，具有清热凉血、利尿通淋的功效。萱草还是一种常用的 染料并可被用作监测是否受到氟污染的植物，是一种极为可贵的植物 资源。 萱草结实率极低，种子繁殖变异大，目前～般采用分蘖方式进行增殖，1 株萱草每年仅可繁殖4,--,5株，繁殖系数低，特别是一些优良品种，难以适应市 场商品化生产的要求l螺l。因此，建立萱草有效的离体褥生和快繁体系是解决优 良品种推广应用的关键问题之一。萤草离体培养在国外研究较早，Meyer 研究。我国对萱草组织培养研究较晚，近些年来，杨乃博(1985)、郭达初(1990)、 吴铁器(2002)等陆续舞展了此方惹的研究，但研究结果有掰差异f22~2射。 4 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 1．3植物生长调节剂的应用 近数十年内，对植物生长调节剂的研究进展迅速。植物生长调节剂调节植 物的生长发育，已逐渐成为当前农业科学研究中一个十分活跃的领域。植物生 长调节剂种类繁多，根据其生理功能可以分为植物生长促进剂、植物生长 剂和植物生长延缓剂三类。植物生长促进剂主要有生长素、赤霉素、油菜素内 酯等化合物，能促进植物生长。植物生长剂常用的有脱落酸、乙烯、水杨 酸、茉莉酸甲酯、三碘苯甲酸等，其主要作用是植物茎部顶端分生组织的 生长。植物生长延缓剂主要有多效唑、矮壮素、比久、皮克斯等，主要植 物茎部近顶端分生组织，经生长延缓剂处理的植物各部位被矮化【291。 目前，植物生长调节剂主要应于农业生产。植物生长调节剂在控制萌发和 生长、促进插枝生根、矮化株形、防止落花落果、疏花疏果、保水保果、控苗 促苗，形成无籽果实、控制花性别、增加产量、提高抗逆力等方面显示出 重要的调控作用【州。例如，用矮壮素水剂浸小麦种子，拔节期再喷施1次，可使 植株生长粗壮。用矮壮素处理蕾期棉株或结桃初期棉株，能防止疯长，增加棉 铃。在大豆初花期用三碘苯甲酸液喷雾，有顶端优势、促进光合、增花保 荚、促进早熟等作用【3¨。以350 mg／L的多效唑在蓖麻主花序现蕾期喷施，处理 后能延长蓖麻生育期、营养生长、促进生殖生长、增强蓖麻的抗病性和抗 逆性，达到增产的目的。可见，植物生长调节剂的应用日渐得到重视，某些生 长调节剂的应用已成为农业生产技术的一部分。 另外，植物生长调节剂也可用在花卉等观赏植物生产中。植物生长调节剂 能有效地调整株型、调节花期、加深叶色、延缓衰老、促进生根、增强抗逆性、 改善植株的综合观赏指标。已在菊花、串红、中国水仙、矮牵牛、牡丹、彩色 马蹄莲、金鱼草、墨兰、郁金香、海桐、雀舌黄杨等多种观赏植物上取得了良 好效果【32】。 不仅在常规栽培中用到，植物生长调节剂尤其是生长延缓剂在植物组织培 养及离体种子保存中也被广泛应用。黎建玲研究发现，多效唑能明显提高金钗 石斛试管苗再生芽分化的数量，促进再生苗根的分化，提高生根的数量，并对 再生植株有明显的矮化作用133J。培养基中加入多效唑0．2、O．4、0．6 mg／L，可 5 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 使非洲菊组培苗健壮、矮化，提高增殖系数；在生根培养基中加入0．2～1．0 me,／ L多效唑，可增加生根量，促进根的增粗，提高移栽成活率…。1．0m∥L多效 唑能增加重瓣丝石竹组培苗的节数，缩短节间距，使试管苗健壮【35l。余沛涛【36】 发现培养基中加入矮壮素可以使试管矮牵牛矮化、枝叶紧凑、叶片颜色加深， 实现试管内株型调整；当矮壮素浓度为0．1 mg／L时，对矮牵牛花苞的形成最有 效。在种子保存中，常规方法较为困难，采用组织培养既可保存优良种子，也 可避免病原侵染。培养基中矮壮素质量浓度为1200．00 mg／L，多效唑质量浓度 为4．80 mg／L时，马铃薯脱毒试管苗保存时间最长可以达到300d1371。采用 MS+IBA0．02 mg／I．A-多效唑3．0mg／L基来保存葡萄种质资源，保存最长期限为4 个月【3引。 1．4离体试管苗生根机理的研究进展 1．4．1基因表达与不定根发生 国外对根进行研究的报道很多，所研究的植物主要集中在模式植物拟南芥 thaliana)上，这是因为其根系解剖机构比较简单，且容易获得大 (Arabidopsis 量突变体，而突变体是研究不定根基因表达的最好材料。在拟南芥中，生 长素控制根发育的径和机理已经取得了一定的进展，如AUX／L讼基因 出侧根生长减少或没有侧根的特点。过量表达AUXl、TIRl或者NACl能促进侧 根的发育。过量表达SINAT5能产生较少的侧根13引。 Muller等(1985)【删利用紫外线照射野生型烟草叶肉原生质体获得生长素 抗性的显性突变体rac，该突变体在任何生长素浓度处理下均不能生根， 但能其韧皮部薄壁细胞和内皮层薄壁细胞的细胞。Barbier．Brygoo等 (1990)141】进一步的研究表明，rac突变体通过降低质膜上生长素的结合位点， 降低了对生长素的性，说明根的适宜信号要求较高生长素结合阈值， 细胞和根是两类不同的生长素受体的反应结果。另外，rac突变体的 HRGPnt3基因能地在烟草茎初生根原基或决定次生根发生的细胞中表达 6 三种植物的组织螭弊及生根过程中酶活性的变化 辫l。进一步研究发现，该基因酌转基因植株HRGPnt3一GUS在不定裉矮 激活。说明HRGPnt3mRNA积累是发育和共同作用的结果，该基因的表 达与rac突变俸壤器官发生潜能的有关l韧。 Chen等{蚓以绿霞上、下胚轴，两片真叶和未扩展的二叶的芽为材料，用 h后，使用差异筛选方法(Differential 500／zm的IAA处理3 Screening)得到2个 cDNA克隆(醚1I-3、MII-4)，经一系烈研究表明，IAA霹下胚辘不定投发生的 促进俸用与M E。等入瞪l进行的ROLA、B、C转基因猕 l薹一3的活动有关。Rue,ini 猴桃生根试验发现，ROLA、B、C基因能促进猕猴桃叶盘生根、组培生根。有 研究表明，ROLA、B、C基因同样糍促进玫瑰生根l矧，ROL基因也能够提离烟 草对生长素篷l钥。还有裣树l铸l、苹果雍本鳓、番燕刚、噩类、水稻及玉米 15ll等植物的报道，分离到在根中特意表达的基因包括与信号转导、细胞壁璐成、 细胞周期和细胞循环等相关基因以及一些未知功能的基因。 ．1．4。2内源激素水平与不定根发生 在生根不同时期痰源激素的研究中，徐继忠和陈四维152l盼试验表嘴，在桃 硬技插穗愈伤组织的搬原基形成过程孛，蠹源淤A含量下降，僵不定掇突爨表 皮前内源IAA含量上升到高峰，根突出后又下降。敖红等发现，吲哚乙酸(IAA) 含量和长自落叶松扦插生根之间是有着密切关系的。当插条中硝A含量较离 时，有剩于插条豹生鬏；面当IAA含量低时，则其生根垂滩，可筢是由于IAA 轴进行组培，72h出现IAA高峰，96h可看到不定根原基突出袭皮，IAA含量升 高与不定棂原基几乎露时发生。在生根的不同时期，杰源激素的动力学变 纯沈特定时裳翡含量璺为重要。 光照条件长的豌受组培苗，在根形成前，其茎基部的细胞素水平低， 内源IAA水平在生根的早期有一个峰值，而后含量下降，认为这一峰值与根原 基启动有关，插条生根区早期内源IAA含量升离童要是因为顶端IAA的极性运 输班及撬条基部过氧化物酶(POD)活性降低；酸性POD的活性在生根过程中 7 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 白花泡榈组培试验中，幼年型和成年型茎切段IAA含量分别在的第2d、第 4d达到高峰，与根原基出现的时间一致【571。 露前，被大家的激素有纛大类，其中生长素具有明显的促进不定粳和 侧根发生和生长的作用；乙烯通过调控生长素的代谢起到一定的作用1581。 赤霉素在不定根发生过程中变化的观点不一。长自落叶松伍arixolgensis)扦插 试验表明，GA4的含量增加与插穗不定根的产生呈现正相关性159】。肖关丽等【60J 对甘蔗(Saccha rumofficinarum厶)继代培养绿苗中的内源激素进行测定分柝， 认为GAl、GA3与生根率呈显著负相关性。嚣脱落酸的作用不能确定，弱时， 也有乙烯和脱落酸对不定根和侧根发育的机理方面的报道【61】。 {．4。3酶的活性变化与不定根发生 很多研究表明，一些种类的酶与不定根的发生有关。绿豆下胚轴生根 后24h和12 h，过氧化物酶和IAA氧化酶活性分别升高，与生根呈正相关f翊。 R．N．Chibbar等洚31认为，小豆(Phaseolus mungo厶)插穗不定根发生期闻，IAA Gunes[641 氧化酶活性上升，说明L蚣氧化酶对小豆不定根形成是必需的。Tohit 发生和根原基形成期具有活性，在未生根的欧洲山杨中则无活性，由此推测 IAA氧化酶与插穗生根过程有关，并且有可能通过LAA分解来影响根的形成，即 在根形成期，IAA的氧化产物会促进根发生。 形成根的组织中还存在着丰富的过氧化物酶，在生根过程中，过氧化物同 化物酶活性在生根后鲥升高2倍，然后保持稳定一直到不定根形成末裳；过 氧化物酶活性与形成层细胞、木质部分化和根原基形成密切相关，推测该 酶可能起着调节根原基形成的作用。Tohit nigra tremula三．)在根发生或 L．)、银皇杨(Populus alba厶)、欧洲山杨(Popu缸s 8 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 根原基形成过程中，过氧化物酶活性均上升，但没有发现过氧化物酶活性和生根 能力有显著的相关性，因此认为过氧化物酶活性不影响插穗生根能力和生根率， 胚轴进行生根试验，发现植物内过氧化物酶以多种异构体形式存在，并且参与 了某些植物生理过程，包括生长素分解和细胞壁合成。该研究还表明，过氧化 物酶活性的升高LLtAA氧化物酶活性升高慢。 Yilmaz等人【醴J的研究表明，葡萄插穗生根过程中多酚氧化酶 Hayrullah (Polyphenol 生，这期间多酚氧化酶的活性与根形成呈正相关关系，根形成后多酚氧化酶活 定根的发生有着非常一致的联系。有分析认为，多酚氧化酶影响细胞、分 化及根原基的形成和生长，与植物不定根的形态建成有密切关系。 1．4．4多胺水平与不定根发生 Tonon等 一些报道表明，多胺(Polyamine)也与不定根的发生有关。Giustino [70】在垂枝狭叶白蜡(Fraxinus 生根率从76％提高到88％，单独加入腐胺、亚精胺、环己胺或氨基胍等均能使生 根率提高到100％，混合使用则生根。Marie．ClaireHeloir等17”发现胡桃嫩 枝组织培养过程中，游离多胺浓度在嫩枝被转移至生根培养基后便迅速上 升。F．LeGuen．LeSaos等【72】发现在培养基中添加0．5mM的腐胺，能够提高朝 鲜蓟(Cynarascolym 的植类可能由以下两个因素决定：①生根阶段之前的游离PA含量；②在生 根需要游离PA时，即生根培养前2d中结合多胺的累积情况。 1．4．5外植体类型与不定根发生 1．4．5．1基因型 不同植物的生根能力或生根潜能有很大的差异，即使是同一种植物不同的 9 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 基因型其生根也存在很大的差异。汤浩茹等【73l研究了培养基和培养条件对4个梨 基因型试管苗生根的影响，结果表明，在4个实验品种中，巴梨、考密斯生根速 度较快，培养14d左右就能分化出可见的原基，而身不知和早酥梨在18d时 处理条件下，红枫生根率最高60％，其次为日本枫26％，糖枫最低15％。王关林 等I75】研究发现，蝶形花亚科8种槐树的生根能力不同，生根率最高的金叶槐(93． 9％)是生根率最低的红花槐的2倍以上，表明不同种(变种)槐树对生长素的 依赖性不同，要求的植物生长调节剂浓度有差异，在生根的时间、不定根的数 量上也不尽相同。李火根等I_76】试验发现红杉不同基因型对扦插生根也有显 著的影响，表明生根特性存在遗传变异。 1．4．5．2试管苗的继代次数 培养物的不同继代时间也影响试管苗的生根。郎(2003)177]实验发现， 随着继代次数的增加，梨枣试管苗的叶片增多，生根株率增加，到第8代时， 随着继代培养次数增加，生根效果会提高。苹果“红玉”品种，试管小插条生根 率只有8％，经过9次继代培养，则生根率可达95％。而“元帅”品种需继代3年 多才能生根。冯学赞等(1997)[78】通过气培法研究珠美海棠芽苗生根时发现， 经过12次继代的芽苗才可达到较高的生根率，木本植物组织培养中这种现象 可能是由于延长继代培养带来的复幼效果。幼态的木本植物材料比成熟或衰老 的材料容易生根。 1．4．6培养基成分与不定根发生 1．4．6．1无机盐类 一般而言，试管苗生根均需要在低盐培养基中进行，这是由于盐浓度变化 导致培养基渗透压变化，从而影响试管苗对营养吸收和向培养基中物质， 而且盐浓度的变化也使植株体内氮浓度下降到一个适合生根的有利水平【79】。汤 10 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 浩茹【73】研究所采用的4个梨基因型在1／2MS和1／4MS培养基上生根效果较好，而 在梨生根试验中常用的ASH培养基在该试验中生根效果较差。MS基本培养基中 大量元素减半，提高了鳄梨和阿月浑子的生根能力。低盐培养基如White和 Knop培养液也常用于生根培养I删。微量元素硼与生根关系很大，硼通过细胞壁、 细胞膜及蛋白质合成等生理过程的作用，响根系的活力和含氮化合物的运输。 1．4．6．2生长调节物质 生长调节物质是人工合成的具有植物激素活性的化学物质，也叫外源激素。 绝大多数植物的组培繁殖都需添加植物激素。生长素的类型不同，对生根的作 用也不同，一般以IBA最为常用，它比IAA结构稳定，具抗氧化性。胡孔峰等【81J 在研究枸树组织培养时发现同浓度的生长素IBA处理的效果要远远好于NAA效 果，长出的根较粗、易成活。鹰嘴豆分生组织培养时，在MS中单独加人生长素 IBA时即可发根。 如IAA和NAA或与BA浓度组合都不能生根，而转人1．0∥g／L 李艳菊【82]以IBA0．1 myL处理元宝枫可获得最佳生根效果。其次，有不少报道以 NAA作为生根激素，NAA为人工合成，作用效果较IBA更为强烈。另外，有时 单独使用一种生长素不能获得较高的生根效率，则需几种生长素复合处理。如 IBA和NAA各以o．2 mg／L浓度配合处理白木香试管苗可获得最佳生根效剽83l。 在生根培养基中一般没有细胞素，但有时较低的细胞素和较高的 生长素组合可以产生理想的生根结果。闰道良【删等发现在钟花樱的生根中 低浓度的细胞素是必要的，0．01mol／L6-BA可刺激生根。在粉叶复叶槭的 组织培养中，BA0．02 mg／L+NAA0．05mg／L为最好的生根处理组创85J。乐昌含笑 外植体离体培养在BA浓度为O．4 m∥L、NAA、IBA浓度分别为0．8mg／L、0．6mg／L 时，生根率最高l酌J。 根发生需要建立一种最佳的内源生长素一细胞素平衡。值得注意的是， 植物激素的用量要考虑组织内源激素的含量及其生理学周期效应。到目前为止， 人们对植物激素的作用机理了解甚少，大多是凭借经验或通过实验来确定激素 种类及其浓度。这也正是组培快繁的难点和关键所在。 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 1．4．6．3 PH值 基质初始PH值也是植物组织培养生根的影响因子，不同的植物要求的酸碱 度不同，大多数植物适生于弱酸性，PH值为5．6．-一5．8，但亦因植物培养的 不同种类、不同部位及不同生理状态而异【87J。关于PH值对生根影响的研究较少。 有报道说，PH值显著影响小萝卜幼苗切后则根的形成，PH值由3．8升N5．3，则 的pH影响IBA的吸收，但不影响根期的代谢活动。吴传兵188J实验发现， 水花生在碱性溶液中比在酸性溶液中生根情况好，当pH值在8．85左右时生根情 mm，根数为60根以上。PH对生姜脱毒苗的出根和根的伸 况最好，根长为26．2 长有一定的影响，但没有表现出一致的规律，在PH4．0,--,8．0水平都能良好生长， PH5．8条件下出根数和根长均为最佳18引。 1．4．7其他成分 糖是培养基的碳源，为细胞提供合成新化合物的碳骨架，为细胞的呼吸代 谢提供底物与能源。糖的存在与否，以及浓度大小对生根的影响可解释为是由 于碳源缺乏引起无根苗的饥饿或渗透压处于亚最适水平或超最适水平。忠 等(1991)190l将山楂新梢接种到分别含有不同蔗糖浓度的生根培养基中，当蔗 糖浓度大于或等于87．64mmol／L时，1周后少数新梢基部出现不定根。新梢生根 mmol／L时，生根率最 率和生根条数随蔗糖浓度增加而提高，蔗糖浓度为116．86 导难生根的橄榄插条，不能其生根，将蔗糖和IBA配合使用，促进橄榄插 条的生根率、生根数量和根的生长。李胜等【91】试验结果表明，蔗糖浓度在5～25 g／L范围内，随蔗糖浓度增加，葡萄根系的发生推迟。 不同的糖种类对生根的影响不同。192】在研究糖对苹博一号(苹果)生 根影响时发现，2％的蔗糖比其它浓度的蔗糖更有利于生根，生根率为43．5％。 而在含有绵白糖的培养基上始终不形成根，苗枯黄而死。在含有葡萄糖的培养 12 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 基上，根原体形成最早，且诱根率也稍高。 1．4．7．2琼脂 生根试验中，琼脂浓度范围在O(液体培养基)-0．9％之间，一般添加O．5％～ 0．6％琼脂就可固化。琼脂浓度显著影响葡萄试管苗生根，随着琼脂浓度的增加， 根原基产生时间延迟，平均根长和根冠比降低，而平均根粗和生根数增加189J。 降低琼脂浓度可以增大接触面积，有利于对营养物质的吸收。毛元荣【93】的试验 结果表明，液体培养基上的杜鹃枝条长出不定根，固体培养基未见根的分化。 孙书伟194J在香花槐生根试验中发现，液体培养基的生根明显快于固体培养基。 1．4．7．3活性炭(AC) 活性炭在培养基中能吸附有毒物质，而且活性炭在离体培养中对根系具有 遮光作用，给组培苗生根提供了一个暗，从而避免强光对根生长的， 提高生根质量。一般活性炭和生长素一起使用。新疆雪莲的生根培养基中添J]fll mg／LAC，根数最多达13条，生根效果最佳【951。活性炭在生根方面具有两 面性，一方面因吸附培养基中的非极性物质和色素等有害物质而促进生根，另 一方面也因吸收生根所必须的生长激素和其他营养物质而生根。楹椁和李 AC显著降低了生根率和 培养中，在改[曼Quoirin．Lepoivre培养基上加人500mg／L 每株生根数。在李和樱桃生根培养中，AC还会引起黄化和生根率的显著降低。 1．4．7．4酚类物质 不少研究表明，酚类化合物和生根作用有一定关系196】。1976年Tones首次 果根形成和无根苗生长的促进作用。槲皮酮和芦丁能促进桃树根的发生；儿茶 酚能促进杨树根的形态建成；槲皮酮和芦丁对胡桃芽苗的生根也能起到促进作 用，并且在和IBA配合使用时产生相加效应197J。 至今对酚类物质影响生根的作用机理尚不是很清楚，一般认为它们对根发 生的促进或作用是通过与生长素相互作用实现的。另有报道认为：酚类化 13 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 合物很可能是通过影响内源IAA的水平而对生根产生或促进作用的。 1．4．8培养条件与不定根发生 1．4．8．1光照 中对欧洲甜樱桃(P．avium)进行生根培养，生根率达到80％。中国樱桃暗 处理5d可取得最佳生根效果【981。也有研究表明暗培养对生根并无很好的促进作 用，孙清荣等(2004)对西洋梨试管苗生根试验中发现，暗培养3天比直接光培 养生根率虽有所提高，但差异甚微，暗培养超过3天则生根率下降。 1．4．8．2温度 根据报道，温度对香蕉组培苗增殖和生根均有极显著的影响，温度在16--．， 28℃之间，香蕉的生根率随温度的升高而增大，尤以25～28℃最适宜。果树一 般在21～30℃范围内生根，苹果无根苗在28C生根最佳。葡萄试管苗在20、25、 30。C3种温度条件根数无显著差异，平均根粗随温度的升高略有下降【9l】。 1．4．8．3湿度 湿度对生根的影响没有系统研究。Zane(1979)观察到在试管中增加湿度和 苗数，生根会更好。但在李树组织培养中，温度增加会引起试管苗的玻璃化。 1．4．8．4通气 Yu等(2000)发现生根介质的通气状态对番木瓜生根率和存活率有很大 的影响。在通气琼脂中为42．2％，非通气的为35．6％；生根后的完整植株在通气 蛭石上驯化的存活率是94．5％，非通气为87．8％；在通气和非通气琼脂上驯化的 存活率分别为42．2％和35．6％。 · 14 三种植物的缌织培养及生根过程中酶活性的变化 1．5本论文目的与意义 本论文分别以紫时挪威槭休眠芽、一品红带腋芽茎段、萱草嫩茎为外植体 材料，进行组织培养。实验所选取的三种植物材料均具有～定的观赏、经济和 生态价值，但在自然条件下其繁殖系数低，增殖速度缓慢，优良品种艨代变异 性大，难以满足人们的需求。嚣此对其进行离体培养，建立快繁体系具有一定 的应用价值，也为进一步的生理生化研究提供了良好试材。其中紫叶挪威槭的 组织培养和快速繁殖国内外尚未见报道，本研究通过大量实验摸索，建立了一 套切实可行的再生体系线，成功填孙了这一空自，对加快紫叶挪威槭的扩大 繁殖将有重要的经济效益和社会效益。 首次研究了植物生长调节剂DPC和复合VB对一品红试管苗生长、芽增殖 和生根的影响，筛选出利于试管苗生长发育的调节剂种类和浓度，实现瓶内株 型调整，提高一品红的观赏性，也为植物生长调节剂在组织培养上的应用提供 参考。 近年来植物组织培养技术发展十分迅速，但离体生根困难仍然是组培中急 待解决的瓶颈问题。本实验在褥生体系建立的基础上，研究了三穗植物生根诱 导过程中过氧化物酶(IAAO)、吲哚乙酸氧化酶(POD)活性变化趋势，发现 易生根的萱草和一品红IAAO、POD活性变化趋势存在一定的规律性及相似性， 丽与不易生根的紫叶挪威槭IAAO、POD活性变化趋势有较大差异。初步探讨 对植物生根的调控作用，对解决难生根植物生根问题有实际意义，也为更深入 研究生根机理提供实验基础。 15 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 第二章三种植物组织培养与快速繁殖的研究 2．1紫叶挪威槭再生体系的建立 紫叶挪威槭(Acerplatanoides‘CrimsonKing’)又名红帝挪威槭、国王枫等， 是极具魅力的观赏树种，非常适合庭院造景及园林绿化，幼苗市场需求量大且 价格贵。紫叶挪威槭的繁殖主要采用常规的扦插和播种繁殖方法，扦插繁殖系 数低，播种繁殖的后代易产生性状分离，以休眠芽为外植体进行离体培养和植 株再生，可在短期内实现大量快速繁殖，大大加快育苗进程，且保持了母本的 优良性状。目前，紫叶挪威槭的组织培养和快速繁殖尚未见报道。 2．1．1材料与方法 冬季(1月份)取上年生长健壮植株的休眠芽为外植体，先将枝条表皮及 1～2层休眠芽苞片剥去，用软毛牙刷蘸洗涤剂轻刷，流水冲洗30min。在无菌条 件下，用75％的乙醇处理45s，迅速转移至0．1％的升汞中消毒7～8min，无菌水 冲洗5-6次，再剥去1-2层苞片后接种到培养基上。培养温度为(25±2)℃， 光照时间14h／d，光照强度16001x，每处理30个外植体。 2．1．2结果与分析 2．1．2．1基本培养基的确定 以MS和WPM为基本培养基，分别添加BAl．0 mg／L(单位同下)、NAA0．1、 分化及所出的植株生长状态存在明显差异(表2．1)。 16 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 麟 图2．1WPM及MS上培养的情况 2-1 effectondifferentbasemedium Fig Culturing 由以上结果可见，紫叶挪威槭休眠芽在WPM上的及生长明显受到抑 制，植株矮小、拔茎困难、生长缓慢，叶片呈现红色。分析其原因可能是WPM 培养基无机盐和离子浓度较低，PH值较低等，不适于紫叶挪威槭休眠芽的萌发 及生长，植株出现逆境生理表现。且花青素大量累积，呈现增色效应，使叶片 呈现红色。而MS培养基与WPM基本培养基相比，无机盐和离子浓度较高， 渗透势低，以硝态氮为主，糖含量较高，PH值较高，这些特点可能更接近于紫 叶挪威槭生长的内在生理要求，表现为植株挺拔、生长旺盛、叶色嫩绿。确定 MS作为基本培养基。 17 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 2．1．2．2不同外源激素配比对休眠芽的影响 采用BA0．3、0．5、1．0、1．5、2．0 mg／L与NAA0．05mg／L进行组合试验，40d 后观察不同激素配比对休眠芽的影响。 表2．2不同外源激素配比对休眠芽的影响 Table2-2Effect of hormonon budsinduction explant dormancy BA能有效地促进休眠芽萌发，当BA浓度低于O．5 mg／L，明显表现出细胞 素浓度过低，生长点萌发不好，叶片过大，叶柄较长，有的出现一个芽只 具有一片单叶的现象，芽苗长势差。当BA浓度较高(1．0、1．5 rag／L)时，诱 导出的芽苗叶色润泽，叶片大小适中，植株挺拔、长势良好。当BA浓度为2．0 mg／L时，生长点萌发很好，但叶片卷缩不伸展、有畸形的趋势，顶端优势 明显被，且随着培养时间的延长，基部形成的白色疏松愈伤较为严重。 另外，附加GA可较明显地促进休眠芽的萌发及植株生长，有助于茎的拔 高，适宜浓度为1．0mg／L。添加CH增加有机营养，利于植株生长，防止枯项 枯叶现象。进而确定紫叶挪威槭休眠芽的培养基为MS+BAl．0．1．5 300 mg／L+NAA0．05 mg／L。 mg／L+GAl．0mg／L+CH 18 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 2．1．2．3不同外源激素配比对芽增殖的影响 将已出的小苗连同基部的愈伤组织一同转入芽增殖培养基中，在基本 培养基为MS及NAA0．1 mg／L、GA0．5mg／L不变的情况下，附加不同浓度的 BA、ZT形成不同的培养基组合，30d统计结果，并进行分析。 表2．3不同外源激素配比对芽增殖的影响 Table2-3Effectof hormon0nbuds explant multiplication 如表2．3所示，BA浓度是决定芽苗增殖的主要因子，当单独使用BAl．5 mg／L与NAA0．1mg／L组合时，即可实现芽苗的增殖。当BA处于较高浓度(2．0 mg／L)时，芽苗的增殖倍数虽略有升高但愈伤过大，基部小叶愈伤化，影响新 生苗的生长，且更易发生枯顶落叶、烧心苗的现象。当BA处于高浓度(2．5 mg／L) 时，反而了芽苗的增殖。紫叶挪威槭对ZT的芽增殖作用不太， 单独使用不同浓度的zT与NAA0．1 mg／L组合时，不能实现增殖培养。随着ZT 19 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 用量的增加，基部产生大量的愈伤组织，表面有紫红色小颗粒，但难以形成芽 点，其机理有待进一步研究。较低浓度的zT对BA有协同促进作用，ZT0．1mg／L 与BAl．5mg／L组合时，芽增殖效果最好，增殖倍数为4．35倍，植株高度平均为 2．1cm，叶色嫩绿，芽苗生长正常，确定Bll：MS+BAl．5 mg／L+ZT0．1mg／L+NAA 0．1 300 mg／L+GA0．5mg／L+CHmg／L为最佳芽增殖培养基。 紫叶挪威槭芽的增殖是通过两种途径实现的。一种是基部的愈伤生长较快， 继代一次即可从0．5cm2长至1．2cm2，整个愈伤组织表面有绿色颗粒状突起，可 分化出新的芽苗。另外，可由腋芽直接萌发而形成新的芽苗，去掉茎的茎端有 利于实现腋芽发生型增殖。两种增殖类型可在一株试管苗上同时发生。紫叶挪 威槭的芽增殖培养较为困难，未能实现由基部愈伤分化形成大量丛生芽。 试验中还发现，由WPM培养基出的小苗转入培养基Bll后更易发生 芽增殖，且芽苗生长迅速，叶色由红逐渐转绿。推测其原因，可能是由于WPM 基本培养基不适于紫叶挪威槭生长的离子种类、盐浓度、培养基渗透势及PH 值要求，芽苗的发育生长被，生理代谢处于较低水平。相当于经过WPM 上的预处理后再转入MS中，激素作用更为明显，植株体内产生更为强烈 的生理应答，表现为生长状态旺盛。 2．1．2．4不同外源激素配比对继代的影响 将出的小苗转入激素浓度较低的继代培养基中，缓解对顶端优势的抑 制作用，芽苗生长正常，降低植株内的细胞素含量利于下一步的生根。 表2-4不同外源激素配比对继代的影响 Table2-4Effectof hormonOilscbculture explant 20 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 经实验比较(表2-4)，确定C3：MS+BA0．5 mg／L+NAA0．1mg／L+GA0．5 300 mg／L+CHmg／L为最佳继代培养基。 2．1．2．5试管苗的生根培养及移栽 当小苗长至2．5～3．0cm高时，将其从基部剪断转接到生根培养基上进行诱 开始形成根系，40d后统计结果并加以分析。 表2-5不同外源激素配比对生根的影响 Table2-5Effectof hormonon explant plantletsrooting 由表2．5可见，NAA与IBA组合有协同促进生根的作用，比单独使用效果 好。从试验中还发现，只有在NAA、IBA浓度较低时根才能从组培苗基部直接 产生，激素浓度较大时，先产生愈伤组织，根从愈伤发出，由于与形成层缺少 维管束联系，不定根易断。D8的生根率虽然高于D7，但愈伤较大。不附加任 何生长素的D9不能生根。综合考虑，确定生根培养基为D7：MS+NAA0．1 mg／L +IBA0．5 mg／L。生根还与苗龄有关，茎较粗壮即木质化程度高的生根容易，可 能与内源激素积累水平有关，也可能与茎的结构有关。 紫叶挪威槭的生根率不高，不到60％，参考一些相关文献，发现用活性炭 (AC)和间苯三酚(PG)处理，可促进不定根的形成。因此，我们又在D7的 21 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 基础上附加不同浓度的AC和PG，统计对生根率的影响。 表2．6分别附加AC和PG的生根率 Table2-6EffectofACandPGon Rate Rooting 结果表明：在生根培养基中附加活性炭和间苯三酚，均起到很好的促进生 根作用。在活性炭为0．5 g／L、间苯三酚40mg／L时，生根率分别为69．0％和72．4％， 且根的形态正常，愈伤组织较少，植株生长旺盛。最终确定紫叶挪威槭的生根 培养基为：MS+NAA0．1mg／L+IBA0．5mg／】L+PG40mg／L。 敞开瓶口，将生根苗置于室温自然光下锻炼5d，洗去根部的琼脂，移入珍 珠岩和腐殖土(1：1)混合基质中，置于温室小拱棚内，注意保湿遮荫，每周浇 两次无机盐营养液。20d后，逐渐移去靼料薄膜，成活率达80％以上。 霸曩I 皤 图2-2紫叶挪威槭休眠芽 图2-3紫叶挪威槭芽增殖 budsinduction Bud Fi92-2Dormancy Fi92—3 multiplication 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 鼯 图2．4紫叶挪威槭生根培养 图2-5紫叶挪威槭移栽成活 culture andsurvival Fi92-4Rooting Fi92-5Transplantation 2．2一品红再生体系的建立 一品红花色艳丽，花期很长，在我国北方花卉市场上极为畅销且供不应求， 深受人们的青睐。由于一品红结籽少，目前园艺生产上多采用绿枝扦插繁殖， 但由于其体内含有丰富的白色乳汁，导致扦插繁殖速度慢，且茎段易腐烂，成 活率不高。尤其一些优良品种由于枝条少，引进初期数量有限，在一定程度上 了优良品种的繁殖和普及。利用组培方法实现快速繁殖，可在短期内获得 大量优质种苗，带来较高的经济利益。 2．2．1材料与方法 料为带腋芽茎段。从一品红健壮母株上选取长约5cm的带芽枝梢为外殖体，去 cm的带芽茎段接种子培养 菌水冲洗5次，在无菌条件下，将外殖体切成长约1．0 基上。 三种植物的组织培养及生根过瑕中酶活性的变化 2．2．2结果与分析 2。2。2。{芽韵与增殖 根据资料确定一品红的初代培养基MS+BA0．5mg／L(单位下同)+№诅 0。蝤，培养6-8d以后，腋芽开始萌动，15d左右可长出侧棱。茎段切嗣处上端 裂开，下端膨大，产生少量的淡绿色愈伤组织。待侧枝长墅JJ2cm左右时，剪下 接种到添加不同激素的芽增殖培养基上。每25d在原培养基上转接一次，60d后 观察发现，芽增殖情况因处理不同丽有所差异(表2．7)。 表2-7不同外源激素配比对芽增殖的影响 Table2-7Effectof hormonOilbuds explant multiplication 实验结果表明：BA在不定芽的增殖培养巾是必需的，增殖率受到细胞 素的调控，BA在低浓度(O。1 mg／L)下，芽菌生长较快，平均高度高，一般只诱 导腋芽的萌动和生长，形成主茎明显的单一芽苗。当BA浓度为O．3mg／L时，仍 以腋芽萌发为主，茎上腋芽生长紧密；当BA浓度大于等于O．5 mg／L时，明显细 胞素能够打破顶端优势，键进侧芽萌发焉形成丛生芽，并且随BA浓度的增 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 加，增殖系数升高。当浓度达到1．5mg／L时，外植体基部产生大量成簇的小丛生 芽，繁殖倍数高达10倍左右，但株高明显降低，嫩芽长度平均仅为0．6cm左右， 长势不良。即高浓度BA的存在了不定芽的伸长，使有效苗(lcm)的比例 下降，试管苗有愈伤化倾向。另外，在增殖阶段，若素用量过高，残留在 小苗里的细胞素含量较多，容易引起生根困难。因此，确定BA浓度为1．0 mg／L。 BA与低浓度的生长素组合利于芽的增殖，采用IBA增殖效果好于NAA，分 析可能是由于IBA的作用更为缓和，更接近植物体内的生长素水平。最终确定 一品红的芽增殖培养基为A9．MS+BAl．0 mg／L+IBA0．1mg／L。 2．2．2．2继代培养 将出的丛生芽转移到继代培养基MS+BA0．2 mg／I．,+NAA0．05mg／Lqb， 使丛生芽逐渐长高、叶片伸展，形成主茎明显的健壮小苗。注意控制培养基中 BA含量不宜过高，否则会使幼苗保持丛生状态，拔茎困难、生长缓慢、影响芽 苗的质量。待小芽长高将其剪切成1．5cm长的带芽茎段，在原培养基上继续继 代培养。 2．2．2．3根的与幼苗移栽 组培苗的生根，有时以1／2MS为基本培养基可取得良好的生根效果， 如中华矮樱桃在1／2MS+NAA0．5 mg／I培养基中生根率达90．7％，尾叶桉在1／2 MS+IBA0．5 mg／L．暗养基中生根率达95％。本试验以1／2MS为基本培养基，蔗糖 浓度20 g／L，将经继代培养后生长健壮的小苗接入附加有不同浓度NAA(O．05、 O．1、O．2、0．3 mg／L)、IBA(0．2、0．5、1．0、1．5mg／L)的生根培养基上生根， 25d后统计生根情况(表2．8)。 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 表2．8不同外源激素配比对生根的影响 Table2-8Effectof hormonon explant plantletsrootmg 结果表明：无论是NAA还是IBA，在一定浓度范围内均能促进不定根的产 生，且生根率随生长素浓度的增加而上升。实验还发现，添加0．3 mg／LNAA或 1．5mg／LIBA时，生根率高，但基部膨大较为严重，形成少量愈伤，移栽不易成 活。综合考虑生根率、平均根数、平均根长和移栽成活率，最终选择B7：1／2MS +IBAI．0 mg／k为一品红生根培养基。 当试管苗长到3～4cm高，有3条以上的正常根即可进行移栽。具体过程： 打开瓶盖，放置于室内自然光下炼苗3～5d，将苗取出，洗净附着在根部的培养 基，移栽于珍珠岩和腐殖质(1：2)配制的基质中。移栽后一次浇足水分，用塑 料薄膜封盖成拱棚，一般温度控制在22～27。C，湿度在85％左右，在晴朗的 夏季中午应该加盖遮荫网。15d左右，即可逐渐揭开小拱棚通风降温、增加光照， 移栽成活率达95％以上。 图2．6一品红芽增殖 图2．7一品红继代生长 Bud Subculture Fi92·6 multiplication Fi92—7 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 图2-8一品红生根培养 图2．9一品红移栽成活 culture andsurvival Rooting I’i92-9Transplantation Fi醇-8 2．3萱草再生体系的建立 萱草(HemerocaUis hybrida)又称金针花、忘忧草，是百合科萱草属的多 年生草本花卉。本实验探讨了不同植物激素对愈伤组织分化、芽苗增殖、 生根及不同外植体和花茎不同部位对愈伤组织的影响，建立了萱草花茎培 养的有效再生体系和快速繁殖途径，为快速大量生产优质种苗提供参考。 2．3．1材料与方法 试验材料由大连市花木公司提供，用萱草的地下块茎、花茎以及叶片作为 外植体材料进行组织培养。用洗涤灵浸泡30min，然后置于流水下冲洗干净。在 无菌水冲洗5遍。以MS为基本培养基，添加不同浓度配比的BA、KT、NAA和IBA， 将消毒后的材料接到培养基上。 2．3．2结果与分析 2．3．2．1最佳外植体的选择 对萱草的地下块茎、花茎以及叶片进行消毒，结果表明：地下块茎污染率 三种植物的组织培养及生根过程中酶活性的变化 最高，消毒最难，其次是叶片，花茎的污染率最低。不同外植体材料愈伤 的时间也不一样，花茎形成愈伤组织的时间最短，叶片成愈伤组织的时间较长， 地下块茎没有成功出愈伤组织。 表2．9不同部位污染率、出愈率及出愈时间比较 Table2-9Pollution inductionrateandcallusinductiontimeofdifferent rat

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